배경 및 원리

세균의 배양액에 일정한 파장의 빛을 통과시켰을 때 용액은 그 빛을 흡수(혹은 산란)시킬 수가 있고, 이때 흡수된 빛의 양은 용액의 세포농도에 비례함을 이용한 것이다. 분광기에서 시료를 투과한 빛의 세기는 시료 속의 균체수에 반비례한다. 따라서 여러 가지 비율로 희석된 배양액의 흡광도(Optical Density, O.D.)를 잰 다음 각 흡광도에서의 정확한 세포 수를 알아내어 이들의 상관관계를 구해 놓으면 흡광도 측정만으로도 미지의 균체 수를 알아낼 수 있다.


실험 도구(준비물)

SpectraAcademy 1 대
Cuvette cell 1 개
Escherichia coli 배양액(6시간 이상 배양)
LB broth 배지(LB agar 배지(LB broth 배지에 Agar 15/ℓ 첨가))
무균대  멸균된 피펫
멸균된 빈 시험관(희석용)
멸균된 증류


실험 방법

  가. Sample 준비
    1) 멸균된 상태의 배지 100 mL에 Escherichia coli 배양액 1 mL를 접종하여 키운다.(37 ℃,200rp
       m).
    2) 접종 후 4시간 동안 0 time을 포함하여 매 30분마다 시료를 무균조작 방법으로 채취하여 흡광
       도 측정 및 콜로니 계수법을 수행한다.

  나. SpectraAcademy를 이용하여 흡광도(Optical Density or Absorbance) 측정
    1) SpectraAcademy를 흡수/투과모드로 배열한다.
    2) SpectraAcademy와 PC를 USB cable을 이용하여 연결한 후,“Go”버튼을 클릭하여 측정을 시작한
       다.
    3) Light source에 전원을 연결하고, 전원 스위치를 ON 시킨다. 그리고 UV/VIS 전원도 ON 시킨다.
    4) 광원의 안정화를 위해서, UV/VIS 전원을 ON시킨 상태에서 30분간 예열한다.
    5) SpectraAcademy의 SW인 VisualSpectra 2.1 Sr을 실행한다.
    6) UV/VIS 광원을 ON으로 놓고, Shutter를 OFF 시킨다.
    7) 적절한 Integration time, Average, Boxcar 등을 조절한 후, "DARK" 버튼을 클릭하여, Dark Spe
       ctrum을 측정한다.
    8) 7)과 동일한 설정으로 하고, 멸균된 동일 배지로 Reference를 측정한다. VisualSpectra 2.1 Sr
       에서 "REFER" 버튼을 클릭함으로써, Reference를 측정할 수 있다.
    9) 매 30 분 마다 무균 조작 방법으로 시료를 채취하여, 스펙트럼을 측정한다.
       이 때, 0분에서의 OD(Optical Density) 600은 0.08 ~ 0.1로 시작하는 것이 적당하다.
   10) 595 nm 또는 600 nm에서의 흡광도를 기록하고, 이로부터 대수기에서의 Generation time을 간접
       적으로 계산한다.(Generation time은 흡광도의 변화가 2배 될 때까지 걸리는 시간이다.)

  다. 콜로니 계수 방법
    1) 30 분 마다 시료 약 1 mL를 채취하여 멸균된 증류수로 10-5, 10-7, 10-9로 희석한다.
    2) 희석된 시료 200 μL씩을 미리 준비한 LB평판배지 3장씩에 접종한 우에 37℃ 배양기에서 하룻
       밤 배양한다.
    3) 다음 날 자라난 콜로니 숫자를 세어 시료 1 mL당 세균 수를 배양 시간 별로 구한다(세 종류의
       희석배수 중에서 콜로니 숫자가 너무 많아서 셀 수 없거나 또는 너무 적은 경우에는 제외한다).
  ※ 각 시간 별 특정 희석배수에서의 시료 1 mL 당 세균수 = (전체 콜로니 숫자 ÷ 3) × 5 × 희석수
  ※ 주의 사항
     - 시간 별로 시료를 채취할 때, 반드시 무균 조작을 한다.
     - 채취가 끝난 배지는 바로 배양기에 넣어 시간을 지체하지 않도록 한다.
     - 분광광도계를 사용할 때는 반드시 멸균된 동일 배지로 영점 조정을 한 후 사용한다.


실험 결과의 처리

  가. Generation Time 계산
    1) 배양 시간에 따른 세균수의 변화를 반대수(Semi-log) 그래프 용지를 사용하여 그린다.
    2) Generation time(GT)을 계산한다.

       GT = (t × log2)/(logA - logB)

       A : 대수 생장기 두 번째 시점에서의 세균 수
       B : 대수 생장기 한 시점에서의 세균 수
       t : A, B 두 시점 사이의 시간

  나.Generation time 비교
    1) 흡광도 측정을 통해 얻은 Generation Time과 콜리니 계수법으로 계산한 Generation time을 비교
       한다.
    2) 대수기에서의 흡광도 균체수의 상관 관계를 그린다.